在实体瘤 CAR-T 细胞治疗与临床药敏评价中，研究人员通常面临两项核心挑战： 第一，体外模型“失真”：传统的 2D 肿瘤细胞系早就丢掉了患者肿瘤的空间异质性（Heterogeneity）；而常规用胰酶把手术标本消化成单细胞、再埋进昂贵的 Matrigel 基质胶里养出来的传统类器官，不仅培养周期长达数周，而且肿瘤原本的免疫微环境（如抑制性的巨噬细胞、内皮微血管）在消化过程中全军覆没，外源鼠源基质胶还会像一堵墙一样挡住 CAR-T 细胞的浸润！ 第二，临床转化“盲人摸象”：实体瘤靶点高度异质，单靶点 CAR-T 打进去极易因为抗原逃逸而复发，怎么在回输给患者之前，用最快的速度在体外测出“哪几个靶点组合最有效”？

2025 年 3 月，山东大学第二医院神经外科的团队在顶刊 Advanced Science（IF 14.3）发表了题为 Rational Design and Organoid-Based Evaluation of a Cocktail CAR-γδ T Cell Therapy for Heterogeneous Glioblastoma 的代表性成果。 研究团队利用丹麦 Celvivo 的 细胞球类器官实时监控3D培养系统 ClinoStar，开发了一套 非单细胞酶解、完全无外源基质胶（ECM-free）与无外源生长因子 的胶质母细胞瘤患者类器官（GBO）快速构建方案：不仅在 5–8 天内快速成球，总体培养成功率高达 88.46%（23/26 例），死细胞比例 < 10%，更是保留了患者原有的体细胞突变、微血管结构及 M2 型免疫抑制巨噬细胞，成功助推其独创的“prof”多靶点 CAR-Vδ1 T 鸡尾酒疗法进入临床试验（ClinicalTrials 注册号：NCT06572956）！

▲ 图注：山东大学团队提出的“prof”个性化 CAR-Vδ1 T 评价体系，以及利用手术标本在 ClinoStar 中养成的患者来源 GBO 类器官（AO/PI 染色显示细胞活率良好，死细胞比例 < 10%）（图片来源：Zhu et al., Advanced Science, 2025）。

01 | 为什么山大团队放弃“单细胞消化+基质胶”，改用 ClinoStar 组织块悬浮？

在论文第 3 节讨论与第 4 节实验方法中，作者一针见血地指出了传统肿瘤类器官建模的痛点，并展示了 ClinoStar + ClinoReactor 的破局之道：

• 保留原位微环境的“微组织块法”：手术室刚切下来的新鲜胶质母细胞瘤（GBM）组织，无需进行单细胞酶解，而是直接修剪成 0.5–1 mm 的微小组织碎片，直接接种进无菌的 ClinoReactor 培养装置。

• 零基质胶、零外源生长因子干扰：培养基仅采用 50% DMEM:F12 + 50% NeuroGro 配合基础添加剂（N2、B27、胰岛素等），不加一滴 Matrigel 基质胶，也不加 EGF/bFGF 等外源生长因子，将 ClinoStar 设定在 25 rpm 恒速旋转（37°C, 5% CO2, 90% 湿度），每 48 小时换液一次。

• 5–8 天快速建模，成功率 88.46%：在 ClinoStar 温和的微重力流场中，组织碎片无需外源支架即可在 5–8 天（1–2 周）内自组装成浑圆紧实的 3D 类器官（GBO），26 例临床手术标本成功养活 23 例（成功率 88.46%）！同时，团队还将人胶质瘤细胞系 LN229 接种至 ClinoReactor（25 rpm），养出了存活期 超过 2 个月、活率 > 95% 的高圆度 3D 肿瘤球用于初筛。

02 | 组织学与基因组学验证：保留患者肿瘤微血管与 M2 型巨噬细胞微环境

很多临床主任担心：“体外养出来的类器官，跟病人脑子里的肿瘤还是一回事吗？” 山东大学团队用全外显子测序（WES）、单细胞转录组测序（scRNA-seq）和多重荧光免疫组化（mIHC）交出了几乎满分的答卷：

1. 基因突变与干性标志物 1:1 复刻：GBO 完整保留了母本肿瘤的 TP53、EGFR、PTEN 等体细胞突变谱与拷贝数变异（CNV），且胶质瘤干细胞标志物（SOX2、OLIG2、Nestin、BLBP）和增殖标志物 Ki67 的阳性比例与原发肿瘤高度一致。

2. 自带免疫抑制微环境（TME）：单细胞测序（21 个细胞簇、8 大亚群）和免疫组化证实，ClinoStar 养出的 GBO 内部不仅保留了 CD31+ 微血管样结构，还完整保留了原发肿瘤中占主导地位的 CD68+/CD11B+/CD206+ M2 型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs） 及少量内源性 CD3⁺ T 细胞！这为体外模拟实体瘤免疫抑制微环境提供了高保真模型。

▲ 图注：原发肿瘤 GBM 与培养后 GBO 的单细胞 t-SNE 亚群高度重合图，以及 GBO 内部 CD68/CD11B 巨噬细胞与 CD31 血管内皮多重荧光图（图片来源：Zhu et al., Advanced Science, 2025）。

03 | 药效评价应用：利用 GBO 模型定量追踪 CAR-Vδ1 T 细胞浸润深度与多靶点协同杀伤

基于该 GBO 模型，研究团队进一步评估了具有良好组织归巢与实体瘤浸润特性的 Vδ1 γδ T 细胞（无需自体采血，可做成通用现货型 Off-the-shelf 产品）。

• 高内涵 24 小时连续追踪浸润轨迹：将荧光标记的 T 细胞与 GBO 按 1:1 效靶比共培养，按 50 μm 间距画同心圆环定量分析。图像清晰显示：Vδ1 T 细胞的浸润数量和向 GBO 核心深处移动的距离，远超传统的 αβ T 细胞（p < 0.001）！

• 双靶点/三靶点鸡尾酒疗法 24–48 小时清零肿瘤：针对患者肿瘤异质性，单靶点 CAR-T 无法覆盖全部癌细胞；而在 GBO 模型中，双靶点（B7-H3 + IL-13Rα2，覆盖 >80% 肿瘤区）在 48 小时内、三靶点（B7-H3 + IL-13Rα2 + GD2，覆盖 >95% 肿瘤区）在 24 小时内即可有效清除 GBO 内的靶向肿瘤细胞，同时伴随适度的 IFN-γ 分泌（促进 M2 型巨噬细胞向 M1 表型极化），降低了过度炎症反应风险。

▲ 图注：Vδ1 T 细胞 vs αβ T 细胞在 GBO 中的 3D 浸润轨迹追踪图，以及双靶点 CAR-Vδ1 T 共培养 48h 后的红色死细胞（PI）杀伤对比图（图片来源：Zhu et al., Advanced Science, 2025）。

04 | 方案总结：GBO 构建与 CAR-T 评价平台关键参数复用

⚠️ 边界与严谨性说明：本论文由山东大学第二医院神经外科及医学科学研究中心独立完成，受国家自然科学基金（82103144）及山东省重点研发计划资助，与设备厂家无利益冲突。基于该研究建立的临床试验方案已通过伦理审查并在 ClinicalTrials.gov 完成注册（ID: NCT06572956）。本推文由微纳立方市场与技术团队编译整理，旨在分享前沿 3D 培养操作参数；文中涉及的深层分子生物学与免疫学机制，请以英文原版论文为准。